Vědci z Princetonu poprvé odhalili mechanismus toho, jak bakterie buňku po buňce vytvářejí slizké hmoty zvané biofilmy. Když jsou bakterie obalené biofilmy v lidském těle, jsou tisíckrát méně citlivé na antibiotika, takže některé infekce, jako je zápal plic, jsou obtížně léčitelné a potenciálně smrtelné.
Ve studii zveřejněné 6. září v časopise Proceedings of the National Academy of Sciences sledovali inženýři a biologové z Princetonské univerzity jedinou bakteriální buňku, jak vyrostla do zralého biofilmu 10 000 buněk s uspořádanou architekturou. Zjištění by měla vědcům pomoci dozvědět se více o chování bakterií a otevřít nové způsoby, jak napadnout biofilmy pomocí léků.
„Nikdo nikdy nenahlédl do živého biofilmu a nesledoval, jak se vyvíjí buňku po buňce,“řekla Bonnie Bassler, hlavní autorka článku a profesorka Squibb v molekulární biologii na Princetonu a také z lékařského institutu Howarda Hughese. Vyšetřovatel. "S tímto dokumentem můžeme nyní poprvé pochopit, jak společenství bakterií tvoří biofilm."
Objev se stal možným díky speciální mikroskopické metodě, kterou v Princetonu propagoval bývalý postdoktorandský výzkumný pracovník Knut Drescher, která umožňovala zobrazování jednotlivých buněk, což výzkumníkům umožnilo sledovat začínající biofilm v reálném čase.
„Použili jsme nejmodernější techniku, abychom nahlédli do jádra živého rostoucího biofilmu,“řekl postdoktorand Jing Yan, hlavní autor nové studie. Spolu s členstvím v Basslerově laboratoři patří Yan do skupiny Complex Fluids Group, kterou vede spoluautor papíru Howard Stone, Donald R. Dixon '69 a Elizabeth W. Dixon profesorka mechanického a leteckého inženýrství na Princetonu. Yan dále radí starší autor článku Ned Wingreen, Howard A. Prior profesor přírodních věd a úřadující ředitel Lewis-Siglerova institutu pro integrativní genomiku v Princetonu.
"Výzkum, který vytvořil tento článek, leží na hranici mezi vědou o materiálech, inženýrstvím, fyzikou a biologií a představuje fantastickou spolupráci napříč Princetonskou univerzitou," řekl Bassler.
Spolu s Yanem, Basslerem, Stonem a Wingreenem je pátým spoluautorem článku Andrew Sharo, bývalý vysokoškolák na katedře fyziky v Princetonu a nyní na University of California-Berkeley.
Výzkumníci zvolili Vibrio cholerae pro svůj modelový biofilmový organismus kvůli jeho dlouhé historii studia a ohrožení lidského zdraví, které způsobuje průjmové onemocnění choleru. Zakřivená tyčinkovitá bakterie V. cholerae žije jako volně plavající buňka v brakické nebo slané vodě. Když se V. cholerae během nemoci dostane do kontaktu s částicí potravy, třeba na krunýři kraba nebo krevety, nebo s buňkou lidského střeva, bakterie se přichytí a začne se množit. Členové rozšiřující se kolonie vylučují látku podobnou lepidlu, aby se nesmyli a chránili se před konkurenčními bakteriemi.
Předchozí snahy ponořit se do toho, jak buňky v rostoucím biofilmu interagují, selhaly kvůli nedostatečnému optickému rozlišení; v podstatě to, co jedna buňka dělala v neprůhledné hmotě, nebylo možné odlišit od jejích sousedů.
Výzkumníci z Princetonu tento problém překonali několika způsoby. Nejprve geneticky modifikovali bakteriální kmen, takže buňky produkovaly proteiny, které jasně září, když jsou osvětleny specifickými barvami světla. Vybrané proteiny nabízejí nejjasnější dostupnou fluorescenci, což usnadňuje výběr každé buňky a zároveň snižuje intenzitu světla potenciálně poškozujícího buňky potřebného pro experiment.
Tým poté použil konfokální mikroskop, zařízení, které zaostřuje na jednu část vzorku z určité vzdálenosti. Provedením stovek takových pozorování lze snímky poskládat dohromady a vytvořit tak trojrozměrný obraz celého vzorku. "Je to jako dívat se hluboko do nitra biofilmu, aniž byste ho museli rozříznout," řekl Yan.
Další podporu pro výzkumný tým přinesly počítačové algoritmy původně vyvinuté pro obory, jako je věda o materiálech. Algoritmy rozlišovaly blízko seskupené zdroje světla, v tomto případě mnoho nahromaděných buněk V. cholerae v houstnoucím biofilmu.
To, co tým z Princetonu viděl, bylo pozoruhodné. Nejprve se bakteriální kolonie na daném povrchu v experimentu rozšiřovala horizontálně. Když se každá buňka rozdělí, výsledné dceřiné buňky se pevně připojí k povrchu vedle svých rodičovských buněk. Buňky v srdci expandující kolonie byly vytlačeny rostoucím počtem potomků bakterií a byly nuceny se oddělit od povrchu a směřovat vertikálně. Bakteriální kolonie se tak změnila z ploché, dvourozměrné hmoty na rozpínající se trojrozměrnou skvrnu, vše držené pohromadě troškou ve vyvíjejícím se biofilmu.
Princetonský tým se ponořil trochu hlouběji do genetiky za tímto buněčným chováním. Jediný gen, nazvaný RbmA, je klíčem k chování, při kterém se nové buňky spojují takovým způsobem, aby vytvořily trojrozměrný biofilm. Když vědci deaktivovali gen, vytvořil se velký, difúzní a poddajný biofilm. Když však RbmA fungoval normálně, výsledkem byl hustší a silnější biofilm, protože buňky zůstaly navzájem propojeny. RbmA tak poskytuje biofilmu jeho odolnost a poskytuje vhled do potenciální Achillovy paty, která by mohla být zaměřena na terapeutickou intervenci.
Probíhající práce nyní měří fyzické síly, kterým působí buňky povznášející se v centru biofilmu, aby bylo možné přesně vypracovat celkovou mechaniku. "V současné době se snažíme vyvinout matematický model toho, jak bakteriální kolonie roste v čase a jak jsou prostorové rysy spojeny s typickými mechanickými rysy biofilmu," řekl Stone.
Výzkumníci také plánují použít svou novou mikroskopickou techniku ke zkoumání dalších bakterií tvořících biofilm, které stojí za lidskými nemocemi. Jeden příklad: Pseudomonas aeruginosa, hlavní příčina smrtelných plicních infekcí u lidí s cystickou fibrózou. Dalším patogenem je Staphylococcus aureus, běžně nazývaný stafylokok. Je zajímavé, že mechanika toho, jak tyto dvě bakterie vytvářejí biofilmy, by se měla lišit od V. cholerae. Ačkoli buňky P. aeruginosa mají tyčinkovitý tvar jako V. cholerae, mají výčnělky, které jim pomáhají plazit se po povrchu. Stafylokoky jsou kulovité, takže je nelze spojit svými póly.
Techniky, které Yan a jeho kolegové zavedli, by mohly pomoci lékařským výzkumníkům dozvědět se o účinnosti léků s geneticky odlišnými členy stejného bakteriálního biofilmu as biofilmy různé architektury. Budoucí práce by mohla navrhnout způsoby, jak lépe narušit ochranný film, aby antibiotika mohla plně proniknout a zničit choroboplodné zárodky.
